卡梅德生物技术快报｜真菌基因敲除：白念珠菌 SHO1 敲除株构建实验全流程

【实验技术】真菌基因敲除标准化方案可直接复现前言在微生物基因编辑领域真菌基因敲除是验证基因功能、解析调控通路、筛选研发靶点的核心实验技术。本文基于最新研究完整拆解白念珠菌 SHO1 基因真菌基因敲除的实验设计、参数、流程与质控为实验室提供可落地的实操指南。白念珠菌为二倍体真菌需双等位敲除才能完全丧失基因功能传统方法存在表型干扰、转化效率低等问题。本文采用融合 PCRHis/Leu 营养缺陷标记的真菌基因敲除方案稳定实现双等位敲除适合科研与研发场景复用。1 实验设计与材料靶基因SHO1高渗透压信号蛋白 1 基因亲本菌株白念珠菌 SN152His-/Leu-/Arg-筛选标记HispSN526、LeupGAL核心试剂高保真酶、DTT、山梨醇、YPD/MM 培养基仪器PCR 仪、电泳系统、电转仪、凝胶成像仪2 核心步骤真菌基因敲除全流程2.1 菌株活化与缺陷验证甘油菌接种 YPD 培养基35℃过夜活化转接 LB 培养基培养 4h涂布 MM 缺陷平板35℃培养 3–5d确认缺陷性状合格。2.2 融合 PCR 构建敲除盒分别扩增 5 同源臂291bp、3 同源臂264bp、His/Leu 标记片段PCR 体系 50μL模板 2μL、引物各 2μL、水 19μL、高保真酶 25μL程序95℃3min→35 循环95℃15s→退火 55–59℃15s→72℃延伸→72℃5min。融合 PCR 拼接同源臂与标记获得 His 敲除盒2766bp、Leu 敲除盒1095bp1% 琼脂糖电泳回收备用。2.3 感受态制备与电转化菌体培养至 A600≈0.85000r/min 离心 5min1×TE LiAc 重悬35℃、150r/min 处理 45min加 DTT 处理 15min无菌水与山梨醇洗涤100μL 感受态 0.1–10μg 敲除盒0.1mm 电击杯电击条件1.6kV、200Ω、25μF复苏后涂布缺陷平板。2.4 敲除株三重鉴定His 上游608bpLeu 上游361bpSHO1487bp电泳条带与预期一致测序比对无误判定敲除成功。3 表型检测结果生物膜结晶紫染色显示敲除株 OD595 显著降低P0.01黏附缺陷株黏附能力下降P0.05形态菌丝生成受抑以酵母态为主4 实验关键控制点感受态必须使用对数期菌体保证活性融合 PCR 严格控制退火温度避免错配电转化后充分复苏提高阳性率鉴定采用多重验证杜绝假阳性5 总结本方案实现稳定高效的真菌基因敲除解决二倍体真菌敲除难点无标记干扰、无脱靶风险是病原真菌基因编辑的标准化技术方案。参考文献贾克然秦立霞郑洁等。白念珠菌 SHO1 基因敲除株的构建及鉴定 [J]. 中国真菌学杂志2026,21 (1):53-58.