科研人必看！免疫组化IHC实验常用固定剂配方集锦

在免疫组织化学IHC实验中科研人可能会把主要精力投入到抗体选择、抗原修复和显色系统优化上而忽略一个关键的操作步骤固定。固定并不仅仅是“把组织泡起来”的简单操作而是需要精心设计、严格把控的实验艺术。固定需要在分子层面“冻结”生命活动的瞬间保持细胞形态的完整性并保留抗原的免疫反应性。蛋白质的物理、化学性质迥异对应的固定方法和固定液的反应也不尽相同。「IHC诊断室」第7期将系统梳理IHC常用固定液配方及其配制步骤为实验者提供一份可信赖的技术参考。一、甲醛类固定液经典中的经典10%中性缓冲福尔马林NBF和4%多聚甲醛PFA依然是当今IHC实验中应用广泛的固定液。其固定机制在于与蛋白质中的氨基、羟基等基团形成交联稳定组织结构。10%中性缓冲福尔马林配制较简单常规配方如下4%多聚甲醛PFA根据实验目的和使用场景不同有两种配制方法。溶液一的配制步骤(1) 称取40 g多聚甲醛粉末置于三角烧瓶中。(2) 加入500-800 mL 0.1 M磷酸缓冲液PB。(3) 加热至60℃左右持续搅拌或磁力搅拌使粉末完全溶解通常需滴加少许1N NaOH才能使溶液清亮。(4) 补足0.1 M磷酸缓冲液至1000 mL充分混匀。此固定液较适用于IHC研究特别是动物灌注固定取材及后续的浸泡固定2-24 h。固定液较为温和适合组织标本的长期保存。溶液二的配制步骤(1) A液在500 mL的三角烧瓶中配制加热至60℃左右溶解。至多聚甲醛完全溶解后冷却备用。(2) 配制B液和C液。(3) 将B液倒入C液中混合后再加入A液。(4) 用1N NaOH或HCl将pH值调至7.2-7.4。(5) 加ddH2O定容至1000 mL4℃冰箱保存备用。此固定液适用于光镜和电镜免疫组织或细胞化学研究。用于免疫电镜检测时建议加入少量新鲜配制的戊二醛终浓度为0.5-1%。戊二醛属于双醛类固定剂交联能力比甲醛强有利于保存超微结构但对抗原性的损伤也较大。在IHC实验中戊二醛与甲醛联合使用能够满足结构保存和抗原保留平衡的需求。二、传统固定液的改良与创新2.1Bouins液及其改良配方Bouins液是组织学和病理学的传统固定剂由苦味酸、甲醛和冰醋酸组成。苦味酸沉淀蛋白引起组织收缩但不会使组织硬化。Bouins液对组织穿透力较强固定效果好对细胞的微细结构显示清晰适用于富含结缔组织、胚胎及植物组织的标本尤其在Masson三色法中经其固定后组织着色鲜艳。Bouins液常规配方为饱和苦味酸750 mL、40%甲醛250 mL、冰醋酸50 mL混合后移至棕色瓶中存于4℃冰箱。冰醋酸最好临用前加入。改良版Bouins液不加冰醋酸。Bouins液常规固定时间为12-24小时。由于该固定液呈酸性pH 3-3.5对抗原可能有一定损害在固定1-2天后需换入4%的甲醛溶液中保存。目前常用市售饱和苦味酸溶液直接配制。如果你手上是苦味酸粉末则需要一种“邪修”方案了。首先在烧杯中加入1000 mL蒸馏水并不断加入苦味酸粉末边加边搅拌直至有少量苦味酸结晶出现为止。静置并过滤。然后取750 mL苦味酸溶液与250 mL 40%甲醛混匀。最后加入冰醋酸。2.2Zambonis液配方及其配制Zambonis固定液对超微结构的保存效果好于甲醛可用于电镜和显微镜IHC检测。实验室常用配方为2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸固定时间控制在6-18小时。2.3PFG固定液的配制PFG固定液由对苯醌、多聚甲醛和戊二醛构成结合了甲醛快速渗透和戊二醛的强效蛋白交联能力又不影响超微结构的保存适用于电镜样本的制备或对结果稳定性要求高的IHC实验。2.4Karnovskys固定液配制适用于电镜免疫化学检测在4℃短时固定效果好。推荐的操作流程为先进行灌注固定随后浸泡固定10-30分钟。“短时冷固定”策略已成为保存超微结构和肽类抗原的常用方法。读到这里你是否发现IHC固定液的世界远比“倒点甲醛泡一泡”要精彩的多甲醛的“好搭子”远超想象。不同的组合、不同的配比将会在组织或细胞结构中呈现不一样的结果。掌握这些固定液的配制方法将会获得一张特异性强、背景干净的精美片子。